اعتبارات التصميم الرئيسية لبروتوكولات دراسة التحقق من صحة التخليص الفيروسي لمنتجات العلاج الجيني

ICH Q5A(R2)-مؤسسة التناغم الدولية

تم اعتماد ICH Q5A(R2) رسميًا في 1 نوفمبر 2023، وهو يمثل وثيقة التوجيه الدولية الأساسية لتقييم السلامة الفيروسية. بالمقارنة مع Q5A(R1) المنشور في عام 1999، تتضمن التحديثات الهامة في إصدار R2 ما يلي: فصل مضاف حديثًا حول تقييم السلامة الفيروسية في التصنيع المستمر (الفصل 7)؛ تعزيز دور تقييم المخاطر كأساس لاستراتيجيات إزالة الفيروس؛ ودمج تسلسل{{10}الجيل التالي (NGS) في اعتبارات الكشف عن الفيروسات؛ والمتطلبات الصريحة لتقييم المنتجات وعمليات التصنيع الجديدة. تم اعتماد Q5A(R2) من قبل السلطات التنظيمية بما في ذلك FDA وEMA وPMDA، مما يوفر إطارًا تقنيًا موحدًا للتحقق من صحة إزالة الفيروس في جميع أنحاء العالم.

NMPA-النظام التنظيمي الصيني

يغطي الإطار التنظيمي NMPA للسلامة الفيروسية مستويات متعددة:

مستوى الوثيقة	اسم المستند	سنة الإصدار
الوثيقة التأسيسية	المبادئ التوجيهية الفنية لإزالة/تعطيل الفيروسات من منتجات الدم	2002
الوثيقة التأسيسية	المبادئ العامة للمراجعة الفنية لتقييم السلامة الفيروسية للأنسجة البيولوجية-المنتجات المشتقة والخلايا حقيقية النواة-المنتجات المُعبَّر عنها	2005
إرشادات خاصة بالمنتج-.	الإرشادات الفنية للأبحاث الصيدلانية وتقييم تطبيقات التجارب السريرية لفيروس Adeno{0}}ناقل الفيروسات المرتبط (rAAV)-المعتمد على منتجات العلاج الجيني داخل الجسم الحي	2023
إرشادات خاصة بالمنتج-.	المتطلبات الفنية العامة للجودة الصيدلانية لفيروس Adeno{0}}ناقل الفيروسات المرتبط (rAAV)-المعتمد على منتجات العلاج الجيني في الجسم الحي لتطبيقات ترخيص التسويق	2025
المبدأ التوجيهي المبتكر	المبادئ التوجيهية الفنية للتحقق من صحة منصة عمليات التطهير الفيروسي لتطبيقات التجارب السريرية لمنتجات البروتين المؤتلف العلاجي (تجربة)a	2024

ج: يمثل هذا المبدأ التوجيهي المرة الأولى التي تحدد فيها الهيئة التنظيمية الصينية متطلبات فنية منهجية للتحقق من صحة المنصة لعمليات إزالة الفيروس، ويتماشى مع روح ICH Q5A(R2).

FDA وEMA-المتطلبات التنظيمية الأمريكية والأوروبية

أصدرت إدارة الغذاء والدواء (FDA) رسميًا وثيقة توجيه الصناعة بناءً على ICH Q5A(R2) في يناير 2024. بالإضافة إلى ذلك، فصل دستور الأدوية الأمريكي (USP)<1050.1>يوفر إرشادات فنية تكميلية حول تصميم وتقييم وتوصيف إجراءات إزالة الفيروس. تنظم إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) ندوة التطهير الفيروسي كل عامين؛ تناولت ندوة 2023 موضوعات{2}متطورة مثل الأساليب الجديدة، والتصنيع المستمر، ووسائط التحليل اللوني الجديدة، والمرشحات الامتصاصية. تتضمن وثائق التوجيه الأساسية لوكالة الأدوية الأوروبية CPMP/BWP/268/95 (مذكرة لإرشادات بشأن دراسات التحقق من صحة الفيروسات: تصميم ومساهمة وتفسير الدراسات التي تتحقق من تعطيل الفيروسات وإزالتها) وEMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (مبادئ توجيهية بشأن تقييم سلامة الفيروسات للمنتجات الطبية الاستقصائية المتعلقة بالتكنولوجيا الحيوية)، وقد تمت مواءمتهما مع التراث الثقافي غير المادي. Q5A(R2).

تحديد مصادر التلوث الفيروسي

يؤكد ICH Q5A(R2) على أن تصميم التحقق من صحة الخلوص الفيروسي يجب أن يعتمد على تقييم شامل للمخاطر. بالنسبة لمنتجات العلاج الجيني، يجب أن يتناول تحديد مصادر التلوث الفيروسي المستويات التالية:

مستوى البنك الخلوي: الفيروسات الداخلية (مثل جزيئات الفيروسات القهقرية) والفيروسات المعدية الكامنة التي يحتمل أن تكون موجودة في ركائز خلايا الإنتاج (على سبيل المثال، HEK293، CHO، HeLa). من المعروف أن خلايا HEK293 تحتوي على تسلسلات Ad5 E1 داخلية وجزء EBV يبلغ حوالي 900 نقطة أساس، وهي قادرة على التعبير عن الفيروس الغدي المتماثل-المختص؛ ولذلك، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لهذا الخطر في تقييم المخاطر.

مستوى الفيروس المساعد: يستخدم إنتاج ناقلات AAV عادةً طرقًا مثل النقل الثلاثي باستخدام البلازميدات المساعدة، والتي تحمل خطر توليد فيروس غدي مختص (RCA) متماثل. وبالمثل، فإن خلايا التغليف المستخدمة في إنتاج ناقلات الفيروسة البطيئة قد تولد فيروسات lentivirus المختصة بالنسخ المتماثل (RCL).

مستوى المواد الخام: يمكن إدخال الفيروسات العرضية من خلال المواد الخام المستخدمة في التصنيع، بما في ذلك وسائط زراعة الخلايا والأعلاف والإنزيمات. يكون هذا الخطر كبيرًا بشكل خاص عند استخدام المكونات المشتقة من الحيوانات (على سبيل المثال، مصل الأبقار الجنيني، ومحاليل هضم التربسين).

اختلافات المخاطر: العلاج الجيني مقابل البروتينات المؤتلفة التقليدية

البعد المخاطر	منتجات البروتين المؤتلف التقليدية	منتجات العلاج الجيني
مصدر فيروسي	الفيروسات الداخلية من بنك الخلايا. الفيروسات العرضية	فيروسات البنوك الخلوية؛ الفيروسات المساعدة؛ النسخ المتماثل-المتجهات المختصة (RCV/RCL)؛ تكامل الجينوم المضيف
الركيزة الخلية	CHO، NS0، Sp2/0 وغيرها من خطوط الخلايا المميزة جيدًا	HEK293، هيلا، CHO، وما إلى ذلك؛ بعض خطوط الخلايا ذات أصل ورمي
خصائص المنتج	دواء يعتمد على البروتين- بنية محددة جيدًا-	ناقلات الفيروسية. يشكل مخاطر على السلامة الحيوية
استراتيجية التحقق من الصحة	إزالة فيروسية متعددة-خطوات؛ التركيز على التحقق من صحة خطوة العملية	يلزم اكتشاف RCV/RCL؛ التحقق من الصحة والاختبار ضروريان
التحقق من صحة المنصة	تنطبق على العمليات القائمة مثل S/D، وانخفاض الرقم الهيدروجيني، والترشيح النانوي	محدودية التطبيق بسبب تنوع أنواع النواقل

الجدول 1. مقارنة مخاطر السلامة الفيروسية: منتجات العلاج الجيني مقابل منتجات البروتين المؤتلف التقليدية

المبادئ العامة

يعد اختيار فيروس المؤشر عنصرًا أساسيًا في تصميم بروتوكولات التحقق من صحة إزالة الفيروس. يتطلب ICH Q5A(R2) أن يعتمد اختيار فيروس المؤشر على تقييم المخاطر ويأخذ في الاعتبار العوامل التالية:

مدى ملاءمة الفيروس لركيزة خلية الإنتاج (الفيروس ذو الصلة)

الخصائص الفيزيائية والكيميائية للفيروس (مغلف/غير مغلف-، DNA/RNA، نطاق الحجم)

مقاومة الفيروس للعلاجات الفيزيائية والكيميائية

إمكانية اكتشاف الفيروس وسلامته البيولوجية

بالنسبة لمنتجات العلاج الجيني، يجب أن يأخذ اختيار الفيروس المؤشر في الاعتبار بالإضافة إلى ذلك: دور الفيروس الناقل نفسه باعتباره "فيروسًا ذا صلة"؛ الخطر المحتمل للتلوث بالفيروس المساعد؛ ومتطلبات الكشف والتحقق من صحة النسخ-الفيروسات المختصة (RCV/RCL).

الموصى بها لوحة الفيروسات المؤشر

فايروس	يكتب	ظرف	الجينوم	الحجم (نانومتر)	اختيار الأساس المنطقي / التطبيق
MVM	فيروس بارفو	لا أحد	سدنا	18–26	نموذج غير -مغلف؛ أصغر حجم وأعلى مقاومة؛ مناسبة للتحقق من صحة الترشيح النانوي (لا ينطبق بشكل عام على منتجات ناقلات rAAV)
PPV	فيروس بارفو	لا أحد	سدنا	18–26	نموذج غير -مغلف؛ فيروس المؤشر شائع الاستخدام لمنتجات الدم
ريو-3	ريوفيروس	لا أحد	الرنا المزدوج الجديلة	60–80	نموذج غير -مغلف؛ متوسطة الحجم الاستقرار الجسدي العالي
بي آر في	فيروسات الهربس	نعم	dsDNA	150–200	نموذج مغلف حجم كبير نطاق مضيف واسع
X-MuLV	الفيروسات القهقرية	نعم	ssRNA	80–110	نموذج الفيروس القهقري المغلف؛ مناسب لركائز الخلايا المشتقة من CHO-.
بفدف	الفيروسات المصفرة	نعم	ssRNA	40–60	نموذج مغلف يستخدم لتقييم طرق التعطيل الكيميائي (بديل فيروس التهاب الكبد الوبائي)
VSV	الفيروسات المخططة	نعم	ssRNA	70	نموذج مغلف التسامح واسع النطاق لدرجة الحموضة. مناسب للتحقق من صحة تعطيل الرقم الهيدروجيني المنخفض-.

الجدول 2. الموصى بها لوحة الفيروسات المؤشر للتحقق من صحة التخليص الفيروسي لمنتجات العلاج الجيني

اعتبارات خاصة لمنتجات AAV Vector

بالنسبة لمنتجات ناقلات AAV المؤتلفة، تتطلب الإرشادات الفنية NMPA للأبحاث الصيدلانية وتقييم تطبيقات التجارب السريرية لـ rAAV Vector-المرتكزة على منتجات العلاج الجيني في الجسم الحي الاهتمام باكتشاف النسخ المتماثل-AAV المختص (rcAAV). يشير rcAAV إلى AAV القادر على النسخ المتماثل المستقل، والذي ينشأ عادةً من إعادة التركيب المتماثل بين البلازميد المساعد وجينوم AAV المنتج. يتم إجراء الكشف عن rcAAV عمومًا باستخدام فحوصات معدية أو طرق qPCR، يتم إجراؤها بشكل منفصل على مادة الدواء والمنتج المنقى.

تجدر الإشارة إلى أن عمليات التنقية النهائية لمنتجات ناقلات AAV تتضمن عادةً هضم النيوكلاز، واللوني (AEX)، والترشيح النانوي، واللوني للتبادل الأيوني (CEX/IEX). في التحقق من صحة إزالة الفيروس التقليدية، قد تؤدي خطوات العملية هذه إلى خسائر كبيرة في ناقل AAV نفسه؛ لذلك، يجب دراسة التفاعل بين فيروسات المتجهات وفيروسات المؤشرات بعناية أثناء تصميم النموذج المصغر-. بالنسبة لبعض خطوات العملية (على سبيل المثال، الترشيح النانوي) حيث تكون خسائر ناقلات AAV كبيرة، يجب تقييم ما إذا كان هناك ما يبرر تعديلات العملية بناءً على بيانات التحقق من الصحة (على سبيل المثال، تعديل حجم مسام غشاء الترشيح النانوي).

المبادئ العامة

يعتبر نموذج التصغير -(SDM) هو الأداة الأساسية للتحقق من صحة إزالة الفيروسات؛ يجب أن يمثل تصميمه بدقة أداء إزالة الفيروسات في عملية التصنيع. ICH Q5A(R2)، القسم 6.2.2، يتطلب صراحةً أن يحافظ النموذج المصغر - على الاتساق مع عملية التصنيع في المعلمات الرئيسية. بالنسبة لمنتجات العلاج الجيني، تعتبر الاعتبارات التالية ذات أهمية خاصة في تصميم SDM:

تمثيل معلمات العملية الحرجة

يجب أن يكون النموذج المصغر -متوافقًا مع عملية التصنيع في المعلمات التالية: الظروف الكروماتوغرافية (تكوين المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة، والموصلية)؛ نسبة التحميل (نسبة كتلة البروتين الناقل/الطاف)؛ وقت الاتصال ودرجة الحرارة. معدل التدفق/وقت الإقامة؛ نقاء المنتج وتكوينه. بالنسبة لمنتجات AAV، ينبغي أيضًا معالجة تأثير توزيع حجم الجسيمات المتجهة ومحتوى القفيصة الفارغة على أداء الترشيح النانوي على وجه التحديد.

متطلبات التأهيل النموذجي

يتطلب ICH Q5A(R2) مؤهلات كافية للنموذج المصغر-، بما في ذلك: مقارنة سمات جودة المنتج (على سبيل المثال، النقاء، والاسترداد، والكثافة)؛ التأهيل لتناسق معلمات العملية الحرجة؛ والتأكد من أن النموذج المصغر-يلتقط تنوع عملية التصنيع. بالنسبة لخطوات الفصل اللوني، يجب أن يكون اتساق ملف الذروة والشطف والغسيل مؤهلاً؛ بالنسبة لخطوات الترشيح النانوي، يجب التحقق من تأثيرات سعة الحجم وتكوين المنتج.

صيغة حساب LRV

قيمة تخفيض السجل (LRV) هي المقياس الأساسي لقياس فعالية إزالة الفيروس. يقدم القسم 6.5 من ICH Q5A(R2) وصفًا تفصيليًا لطرق حساب LRV والمعالجة الإحصائية. الصيغة الأساسية لحساب LRV هي: LRV=log₁₀(N₀/N)، حيث N₀ هو عيار الفيروس الأولي بعد ارتفاع الفيروس وN هو عيار الفيروس المتبقي بعد معالجة العملية. عندما يقل عيار الفيروس المتبقي عن حد الكشف للمقايسة، يجب استخدام طرق التقدير مثل توزيع بواسون (على سبيل المثال، اختبار الحجم الكبير-).

تطبيق فترات الثقة

يتطلب كل من ICH Q5A(R2) وEMA CPMP/BWP/268/95 تقييم فاصل الثقة لنتائج حساب LRV. يتم عادةً تطبيق فاصل ثقة بنسبة 95%.

معايير الفعالية

وفقًا للإرشادات الفنية الخاصة بـ NMPA لإزالة/تعطيل الفيروسات من منتجات الدم، يشير تقليل الفيروس بما يزيد عن أو يساوي 4 سجلات إلى أن خطوة العملية فعالة لإزالة/تعطيل الفيروس. ومع ذلك، فإن هذا المعيار ليس عتبة مطلقة ويجب تقييمه بطريقة شاملة مع منحنيات حركية التعطيل، والأساس المنطقي العلمي لاختيار فيروس المؤشر، والسلامة العامة لتصميم بروتوكول التحقق من الصحة. بالنسبة لمنتجات العلاج الجيني، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لقدرة الإزالة التراكمية عبر جميع خطوات العملية لضمان أن يكون ملف تعريف السلامة الفيروسية الشامل عند مستوى مقبول.

تطبيقات وتحديات الترشيح النانوي

يعد الترشيح المحتفظ به للفيروسات (الترشيح النانوي) خطوة مهمة لإزالة الفيروس في عملية التنقية النهائية لمنتجات العلاج الجيني. تحتوي المرشحات المحتبسة للفيروسات- النموذجية على حجم مسام يصل إلى 20 نانومتر تقريبًا. آلية إزالة الفيروس في الترشيح النانوي هي في المقام الأول استبعاد قائم على الحجم-، ويمكنها إزالة معظم الفيروسات الأكبر من حجم مسام الغشاء بشكل فعال، بما في ذلك الفيروسات الصغيرة غير المغلفة مثل MVM وPPV.

ومع ذلك، فإن الترشيح النانوي لمنتجات العلاج الجيني يواجه تحديات فريدة من نوعها: حجم ناقلات AAV (حوالي 20-26 نانومتر) يشبه حجم بعض فيروسات المؤشر (على سبيل المثال، MVM، 18-26 نانومتر)، مما قد يؤدي إلى انخفاض استرداد الناقل؛ قد تؤثر الكبسولات الفارغة على تدفق الترشيح وكفاءة احتجاز الفيروس؛ قد تزيد لزوجة العينة بشكل ملحوظ مع تركيز المتجهات. لذلك، يجب أن يأخذ تصميم SDM للتحقق من صحة الترشيح النانوي في الاعتبار بشكل كامل تأثيرات توزيع حجم الجسيمات المتجهة ومحتوى القفيصة الفارغ على أداء الترشيح، وينبغي النظر في استخدام أغشية الترشيح النانوي ذات أحجام المسام الأكبر حسب الاقتضاء.

تقييم التصفية الفيروسية لخطوات الفصل اللوني

يعد كروماتوجرافيا التبادل الأيوني (IEX) خطوة أساسية في عمليات تنقية منتج AAV، وعادةً ما يستخدم هضم النيوكلياز متبوعًا كروماتوجرافيا التبادل الأنيوني (AEX) لالتقاط الكبسولات الفارغة والمعيبة، أو كروماتوجرافيا التبادل الكاتيوني (CEX) للتنقية الدقيقة للكبسولات الكاملة. تتضمن آليات إزالة الفيروس في خطوات التحليل الكروماتوغرافي استبعاد الحجم، والتفاعلات الكهروستاتيكية، وتفاعلات التقارب، وعوامل أخرى. أبرزت المناقشات التي دارت في ندوة التخليص الفيروسي لعام 2023 التي نظمتها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أن فعالية إزالة الفيروس في خطوات التحليل الكروماتوغرافي تتأثر بعوامل متعددة، بما في ذلك قدرة التحميل، ودرجة الحموضة، والموصلية، ودورة الراتينج؛ يجب اعتماد أسلوب تصميم متعامد متعدد-العوامل لإجراء تقييم شامل.

مراقبة السلامة الفيروسية في التصنيع المستمر

يحدد الفصل 7 المضاف حديثًا من ICH Q5A(R2) متطلبات محددة لتقييم السلامة الفيروسية في التصنيع المستمر. بالنسبة لمنتجات العلاج الجيني، أصبح التصنيع المستمر اتجاهًا مهمًا للتنمية، ولكنه يقدم أيضًا تحديات جديدة تتعلق بالسلامة الفيروسية. تتضمن إستراتيجيات التحكم في سلامة الفيروسات في التصنيع المستمر ما يلي:-مرشحات حاجز الفيروسات كإجراءات احتواء حرجة؛ التصميم المناسب لأوقات الإقامة وتدفقات العمليات؛ دمج خطوات التعطيل مع أوقات تعليق محددة؛ والتطبيق المحسن لتقنية تحليل العمليات (PAT) لمراقبة -الوقت الفعلي لمعلمات العملية المهمة.